傳統(tǒng)抗癌藥物體外敏感性測試，耗時(shí)長、假陽性率高，且無法捕捉腫瘤細(xì)胞的個(gè)體差異。中科院蘇州醫(yī)工所宋一之團(tuán)隊(duì)聯(lián)合牛津大學(xué)等機(jī)構(gòu)在《Biosensors》期刊發(fā)表了一項(xiàng)突破性研究——利用單細(xì)胞拉曼光譜結(jié)合重水（D?O）標(biāo)記技術(shù)（Raman-DIP），將藥敏檢測周期從72–144小時(shí)縮短至48小時(shí)，并在單細(xì)胞水平上揭示了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的異質(zhì)性應(yīng)答。一、傳統(tǒng)藥敏檢測的三大痛點(diǎn)
目前主流的體外藥敏檢測方法（如MTT、CCK-8、CTG等）通過檢測細(xì)胞氧化還原酶活性或ATP含量來評(píng)估細(xì)胞活力。然而，這些方法存在三個(gè)難以逾越的瓶頸：痛點(diǎn)一：假陽性率高。試劑本身的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激等因素會(huì)干擾檢測結(jié)果，導(dǎo)致“假敏感"或“假耐藥"的判斷。痛點(diǎn)二：耗時(shí)長。傳統(tǒng)方法需要等待細(xì)胞增殖或死亡，通常耗時(shí)72–144小時(shí)。對(duì)于腫瘤患者而言，漫長的等待可能延誤最佳治療時(shí)機(jī)。痛點(diǎn)三：無法反映單細(xì)胞異質(zhì)性。腫瘤是由具有不同遺傳和代謝特征的細(xì)胞亞群組成的混合群體。傳統(tǒng)群體檢測將所有細(xì)胞“平均化"，掩蓋了耐藥亞群的存在，而這恰恰是治療失敗的主要原因。
二、Raman-DIP：用“代謝指紋"代替“細(xì)胞計(jì)數(shù)"
(1) 方法學(xué)建立：用“碳-氘（C-D）指紋峰"量化單細(xì)胞代謝
傳統(tǒng)拉曼檢測的是細(xì)胞固有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸信號(hào)，但癌細(xì)胞是否“吃"了重水（D?O），才是判斷其代謝活性的關(guān)鍵。ü標(biāo)記原理：研究將HCC827（人非小細(xì)胞肺癌）和MCF-7（人乳腺癌）細(xì)胞置于含D?O的培養(yǎng)基中。代謝旺盛的細(xì)胞在合成新脂質(zhì)和蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)將D?O中的氘（D）原子固定到碳鏈上，形成碳-氘（C-D）共價(jià)鍵。ü光譜指征：我們的拉曼光譜儀在2000~2300 cm?1的“生物靜默區(qū)"（該區(qū)域細(xì)胞自身沒有干擾峰）清晰地捕捉到了一個(gè)全新的特征峰（~2170 cm?1）。該峰強(qiáng)度直接與細(xì)胞內(nèi)新合成的生物大分子量成正比。峰強(qiáng)越高，細(xì)胞代謝越旺盛；峰強(qiáng)下降，則說明藥物起效了。如圖所示，即使在5% D?O濃度下，細(xì)胞在~2170 cm?1處即出現(xiàn)清晰的C-D特征峰，且峰強(qiáng)隨D?O濃度升高而增強(qiáng)。圖1：不同濃度D?O培養(yǎng)下HCC827細(xì)胞的單細(xì)胞拉曼光譜ü計(jì)算模型：研究創(chuàng)新性地定義了“代謝指數(shù)（Metabolic Index）"，公式為：歸一化處理消除了細(xì)胞厚度和激光焦點(diǎn)差異帶來的誤差，使得不同細(xì)胞間的代謝數(shù)據(jù)具備高的可比性。如圖所示，代謝活性在D?O標(biāo)記12小時(shí)后即可被拉曼光譜清晰檢測到。圖2：30% D?O培養(yǎng)不同時(shí)間下HCC827細(xì)胞的單細(xì)胞拉曼光譜
(2) C-D峰強(qiáng)度 = 細(xì)胞代謝活性的“實(shí)時(shí)儀表盤"
與傳統(tǒng)方法相比，Raman-DIP實(shí)現(xiàn)了三大突破：(1)速度突破：研究團(tuán)隊(duì)對(duì)HCC827（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系）和MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞系）兩種細(xì)胞系進(jìn)行了測試。結(jié)果顯示，Raman-DIP將整個(gè)藥敏測試周期從傳統(tǒng)方法的72~144小時(shí)縮短至48小時(shí)。（數(shù)據(jù)顯示:12小時(shí)標(biāo)記已足夠檢出C-D信號(hào)；24小時(shí)標(biāo)記后代謝指數(shù)趨于穩(wěn)定，因此24小時(shí)被確定為最佳標(biāo)記時(shí)間）圖3：30% D2O培養(yǎng)不同時(shí)間下HCC827（B）和MCF-7（D）的單細(xì)胞代謝指數(shù)(2)精度突破：研究團(tuán)隊(duì)對(duì)150個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行逐一拉曼掃描，發(fā)現(xiàn)在同一種高濃度藥物處理下，絕大多數(shù)細(xì)胞代謝被抑制，但仍有約1%的細(xì)胞保持著強(qiáng)烈的C-D信號(hào)——這些正是潛在的耐藥亞群。圖4：不同濃度Crizotinib處理下150個(gè)單細(xì)胞HCC827的代謝比率分布(3) 這種單細(xì)胞異質(zhì)性分析是傳統(tǒng)群體檢測無法實(shí)現(xiàn)的。(4)可靠性突破：拉曼-DIP無需有毒染色試劑，從根本上避免了傳統(tǒng)方法的假陽性問題。研究團(tuán)隊(duì)用8種抗癌藥物在兩種癌細(xì)胞系（HCC827和MCF-7）上驗(yàn)證，結(jié)果顯示Raman-DIP與傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)CTG法的藥敏判定結(jié)果100%一致（靈敏度、特異性、準(zhǔn)確率均達(dá)1.0）。
三、我們的拉曼系統(tǒng)，為Raman-DIP而生
這項(xiàng)技術(shù)的落地，離不開一臺(tái)“懂細(xì)胞、懂代謝"的拉曼光譜儀。我們的（OpenRam HR300）共焦拉曼顯微鏡系統(tǒng)，正是為了這樣的應(yīng)用場景而設(shè)計(jì)：
1.單細(xì)胞級(jí)分辨力
配備532nm/785nm雙波長激發(fā)，兼顧靈敏度和熒光背景抑制；共焦設(shè)計(jì)保證≤1 μm的空間分辨率，輕松鎖定單個(gè)貼壁或懸浮細(xì)胞；高精度電動(dòng)載物臺(tái)（0.1 μm步進(jìn)），支持高通量自動(dòng)尋位和批量譜圖采集。
2.寬譜段、高信噪比
光譜覆蓋范圍400~3400 cm?1，完整覆蓋C-H、C-D、苯丙氨酸等關(guān)鍵生物標(biāo)志峰；采用深制冷CCD探測器，積分時(shí)間僅需2秒即可獲得清晰C-D信號(hào)，有效降低光漂白和光損傷。
3.活細(xì)胞培養(yǎng)與環(huán)境控制模塊（選配）
可集成溫控、CO?和濕度控制單元，讓細(xì)胞在測量全程保持正常生理狀態(tài)；兼容多孔板（96/384孔）或鋁鍍膜玻片，與現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)流程無縫銜接。OpenRam HR300多擴(kuò)展行顯微共聚焦拉曼光譜儀
參考文獻(xiàn)：Wang, J.; Lin, K.; Hu, H.; Qie, X.; Huang, W.E.; Chen, Z.; Gong, Y.; Song, Y. Single-Cell Raman-Deuterium Isotope Probing for Rapid Anticancer Drug Efficacy Sensing. Biosensors2021, *11*(8), 286.
在線咨詢
返回頂部